光遗传：诺奖的种子选手

今年的诺奖已落下帷幕，mRNA疫苗技术的开创者们斩获2023年诺贝尔生理学或医学奖。对于很多人而言，有一项技术是诺奖“遗珠”。

光作为一种电磁波，影响着地球生物的方方面面，譬如光合作用、昼夜节律等生物学过程。这肉眼看来一团耀眼的、五彩缤纷的、却又似乎摸不着的光，神秘又迷人。光对于神经科学的发展，具有重要的影响。具体可以分为三个方面：其一，得益于绿色荧光蛋白GFP（获2008年诺贝尔化学奖）的应用，研究人员可以用荧光标记神经元。其二，将细胞膜上的电压敏感蛋白或细胞内钙敏感蛋白与荧光蛋白偶联，研究人员可以通过荧光的变化监测神经元的活动；而第三个方面，就是用光来操纵神经元的活动，即光遗传学（optogenetic）。

早在1979年，弗朗西斯·克里克（Francis Crick，曾和詹姆斯·沃森共同解析DNA双螺旋结构，1962年诺贝尔生理学或医学奖获得者之一）就曾提出，神经科学目前面临的主要挑战是：在不影响其它细胞的情况下，控制大脑中的某一种细胞。而在光遗传技术出现之前，人们主要通过物理或者化学的方法控制细胞。

可惜的是，现有电极无法精确定位特定的细胞群，而化学药物的作用速度又太慢。直到21世纪初，光遗传的火花照亮了整个神经科学领域。研究人员只需通过光照，控制一个小小的分子开关，“啪——”就可以快速开启或者关闭特定神经元的活动。

一、光遗传的英雄榜

1. 从细菌中发现的光敏元件

故事要从五十多年前说起。1969年，29岁的年轻人迪特尔·厄斯特黑尔特（Dieter Oesterhelt）博士毕业后来到美国加州大学旧金山分校进行博士后的研究。他要研究一种可在高盐浓度上生存的细菌——盐沼盐杆菌（Halobacterium salinarum）的紫色膜结构。

而也正是这次经历，厄斯特黑尔特邂逅了其一生的“学术缪斯”——细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）。厄斯特黑尔特发现盐沼盐杆菌的细胞膜上的这种蛋白，可以作为一种光敏感离子泵，被光快速激活，驱动质子运输，产生化学能，从而使细菌在低氧的条件下仍得以靠光生存。

图注：盐沼盐杆菌NRC-1（标尺=270 nm）。图源：维基百科

后来，厄斯特黑尔特的学生彼得·黑格曼（Peter Hegemann）继承了老师的衣钵。他不仅与厄斯特黑尔特一起分离了另一种氯离子特异性的光敏感离子泵，即盐视紫红质（halorhodopsin），还将对光感受器的探索延伸到了其它生物体系——莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中。基于以往的研究经验，黑格曼敏锐地猜测莱茵衣藻的趋光行为可能也和一种光敏蛋白有关。

功夫不负有心人，在长达数十年的探索后，黑格曼等人终于在21世纪初成功鉴定了通道视紫红质1（ChR1）和通道视紫红质2（ChR2）。两者感光之后，引起细胞去极化，产生光电流，最终触发衣藻鞭毛的趋光运动。

图注：莱茵衣藻。图源：维基百科

上文描述的光敏蛋白——细菌视紫红质、盐视紫红质和通道视紫红质，已在光遗传学中找到用途。天然存在的细菌视紫红质（该家族的第一个发现的成员，将质子泵出细胞）和盐视紫红质（将氯离子泵入细胞）通常在神经系统中具有抑制作用，因为这两种类型的超极化电流使神经元更难激发动作电位；相反，天然存在的通道视紫红质大部分允许带正电荷的离子自由流过视蛋白孔，因此倾向于使神经元去极化和兴奋。

图注：靶向激活（如蓝光激活的通道视紫红质）或抑制（如黄光激活的盐视紫红质），可以实现对神经元快速且细胞特异的甚至是投射特异的操纵。图源：参考文献1

2. 三支力量的击鼓传花

光敏蛋白的发现也许为光遗传的诞生开了一个好头。但如何将光敏蛋白与神经元操纵结合，仍有待时代弄潮儿们的临门一脚。于是时间推进到20世纪末21世纪初，有三股力量对于光遗传的产生，起到了尤为重要的推动作用。

第一支是来自奥地利的神经科学家格罗·米森伯克（Gero Miesenböck）团队。米森伯克想到可以通过光敏蛋白来实现对神经元的操纵，遗憾的是一直没有找到比较高效的光敏蛋白的分子工具。直到2002年，米森伯克开创性的工作表明，在脊椎动物神经元中异源表达三个果蝇的光感受器基因，可以通过光刺激激活特定类型的神经元。

另一支便是彼得·黑格曼和他的合作者格奥尔格·纳格尔（Georg Nagel）团队。2002-2003年间，纳格尔和黑格曼先后鉴定了莱茵衣藻趋光行为中关键的通道视紫红质ChR1和ChR2蛋白，并在其它物种的细胞中，创新性地异位表达这些蛋白，证明其异位表达仍保留光激活的离子通道的活性，并且仅需表达一个蛋白就可以实现。纳格尔和黑格曼的工作为光遗传技术提供了非常简单有效的分子工具。

最后一支则是爱德华·博伊登（Edward S. Boyden）和卡尔·迪赛罗斯（Karl Deisseroth）团队。他们则是将ChR与神经元操纵完美结合。2005年，博伊登和迪赛罗斯等报告了一项具有里程碑意义的研究工作：他们在海马神经元中仅表达单分子ChR2，就可以通过光以毫秒级的精度触发特定神经元动作电位，简洁又优雅地构建了光遗传的基本范式。（博伊登和迪赛罗斯团队后续还改良了这种工具，使研究人员可以快速且精确地沉默特定神经元。）

2006年，迪赛罗斯将这种工具正式命名为“光遗传学”。光遗传学很快被广泛应用于生物学各个领域。

3. 近年来光遗传所获主要奖项

2018年，彼得·黑格曼、爱德华·博伊登、卡尔·迪赛罗斯获加拿大盖尔德纳奖国际奖（Canada Gairdner Award）。

2019年，彼得·黑格曼、格罗·米森伯克，爱德华·博伊登和卡尔·迪赛罗斯获沃伦·阿尔珀特奖（Warren Alpert Foundation Prize）。

2020年，彼得·黑格曼、奥尔格•纳格尔和格罗·米森伯克获邵逸夫生命科学与医学奖（The Shaw Prize）。

2021年，迪特尔·厄斯特黑尔特、彼得·黑格曼和卡尔·迪赛罗斯获拉斯克基础医学研究奖（The Lasker Awards）。

遗憾的是，迪特尔·厄斯特黑尔特先生已于2022年逝世。

图注：截至2015年统计，光敏蛋白和光遗传学的出版时间轴。近些年来，与光遗传有关的研究的数量急剧上升。图源：参考文献12

光遗传方法详解

光遗传学能够以毫秒级的速度、细胞类型特异性的精确度，对诸如自由移动的哺乳动物这样复杂的生物系统进行光调控。这项神奇的技术，主要涉及三个核心环节：（a）光敏蛋白家族，这类蛋白可以在光刺激的条件下发生结构改变，触发跨细胞膜的离子流动；（b）将目标视紫红质蛋白靶向表达在特定脑区的特定细胞类型中；以及（c）时空精确性地在特定的脑区和细胞类型中施加光刺激。

而在一般的光遗传学实验中，主要有以下六个步骤：

首先，研究人员需要构建一个同时包含ChR2基因（或其它光敏蛋白）和控制其表达的遗传元件（如细胞类型特异性的启动子序列）的表达载体；

随后，将表达载体包装到病毒中；

接着，将病毒注射到动物的大脑中。虽然病毒会广泛地感染神经元，但视紫红质蛋白仅在具有激活其特定启动子所需机制的细胞亚群中表达。由此，实现了光敏感的视紫红质蛋白的细胞类型特异性的表达。表达的视紫红质蛋白定位到这些神经元的细胞膜表面；

第四，在动物头骨埋入光纤；

第五，沿着光纤，用特定波长的光触发这些视紫红质蛋白的活性；

最后，对监测到的电生理和行为学的数据进行记录。

图注：光遗传学的基本实验步骤。图源：参考文献15

三、光遗传如何发挥作用？

2010年，光遗传技术获评为《自然-方法》（Nature Methods）杂志的“年度方法”，同年被《科学》（Science）杂志评为近十年来的突破之一。这项技术的应用范围可总结为两个方面：一个方面是，对于神经环路功能的基础研究；另一个方面则是对特定疾病的临床治疗。

1. 基础研究：“成功是成功之母”环路的发现

2007年发表的第一篇在动物体内应用光遗传技术的文章，研究了分泌下视丘分泌素（hypocretin）的神经元的功能。研究人员通过光遗传的方法刺激侧丘脑区域下视丘分泌素分泌神经元的活性，明确该神经元参与小鼠睡眠-觉醒状态的转换。

光遗传技术还被应用于解释一些精神类疾病发病的生理机制。比如，光遗传学已经优雅地证明了伏隔核的胆碱能中间神经元在可卡因条件反射中的重要作用，中脑多巴胺神经元在慢性轻度应激诱导的抑郁样表型中的重要作用；或皮层-纹状体神经环路在强迫行为机制中的重要作用以及内侧前额叶皮层到基底内侧杏仁核的神经环路在焦虑中的作用。

值得一提的是，2017年，浙江大学胡海岚团队通过光遗传等技术，在小鼠中验证了“胜利者效应”。证明了从背内侧丘脑到前额叶皮层区域的神经环路介导了竞争中社会支配地位的长期改变，并且这些改变受到过往胜利经历的影响。

图注：光遗传让“败鼠”变强。光刺激丘脑-前额叶的神经环路，让原先竞争中占弱势地位的小鼠获得了战斗力。图源：参考文献18

2. 临床治疗：“让失明者复明”的光治疗

2021年，《自然-医学》上发表了一篇将光遗传学技术应用于治疗神经退行性眼疾——视网膜色素变性病的研究工作，首次实现了患者功能的部分恢复。实验中，研究人员在失明患者眼内注射携带光敏蛋白的病毒载体。随后对患者的眼睛施加光刺激，激活通过光遗传技术改造的视网膜神经节细胞。

经过上述治疗过程，患者的眼睛就能感知、定位、计数和触摸不同的物体。而在患者视觉感知过程中，多通道脑电图记录显示出与物体相关的活动位于视觉皮层之上，意味着患者视觉功能的部分恢复。

图注：光遗传让失明者“复明”。图源：参考文献23

正如《自然-方法》中提到的那样，利用光来调节特定细胞中的特定活动，在生物学研究中取得了巨大成就，并照亮了尚未探索的科学道路。

参考文献

1.Deisseroth， K. Optogenetics. Nat Methods 8， 26–29 (2011).

2.Oesterhelt D， Stoeckenius W: Functions of a new photoreceptor membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973， 70:2853–7.

3.Oesterhelt D， Stoeckenius W: Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Nat New Biol. 1971， 233:149–52.

4.Hegemann P， Steiner M， Oesterhelt D. Isolation and characterization of the retinal-binding component of halorhodopsin. EMBO J. 1982;1(10):1177-83.

5.Harz， Hartmann， and Peter Hegemann. "Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas." Nature 351， no. 6326 (1991): 489-491.

6.Andersson， M; Malmerberg， E; Westenhoff， S; Katona， G; Cammarata， M; Wöhri， A. B.; Johansson， L. C.; Ewald， F; Eklund， M; Wulff， M; Davidsson， J; Neutze， R (2009). "Structural dynamics of light-driven proton pumps". Structure. 17 (9): 1265–75.

7.Liu YY， Zeng WY， Chen R， et al. Tactic movement of microalgae and its application in targeted transport: a review. Chinese Journal of Biotechnology， 2022， 38(2): 578-591

8.Zemelman BV， Lee GA， Ng M， Miesenbock G: Selective photostimulation of genetically chARGed neurons. Neuron. 2002， 33:15–22.

9.Nagel， Georg， Bettina Möckel， Georg Büldt， and Ernst Bamberg. "Functional expression of bacteriorhodopsin in oocytes allows direct measurement of voltage dependence of light induced H+ pumping." FEBS letters 377， no. 2 (1995): 263-266.

10.Nagel， Georg， Doris Ollig， Markus Fuhrmann， Suneel Kateriya， Anna Maria Musti， Ernst Bamberg， and Peter Hegemann. "Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae." Science 296， no. 5577 (2002): 2395-2398.

11.Nagel， Georg， Tanjef Szellas， Wolfram Huhn， Suneel Kateriya， Nona Adeishvili， Peter Berthold， Doris Ollig， Peter Hegemann， and Ernst Bamberg. "Channelrhodopsin-2， a directly light-gated cation-selective membrane channel." Proceedings of the National Academy of Sciences 100， no. 24 (2003): 13940-13945.

12.Deisseroth， K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nat Neurosci 18， 1213–1225 (2015).

13.Boyden， Edward S.， Feng Zhang， Ernst Bamberg， Georg Nagel， and Karl Deisseroth. Millisecond-timescale， genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci 8， no. 9 (2005): 1263-1268.

14.Deisseroth K， Feng G， Majewska AK， Miesenböck G， Ting A， Schnitzer MJ. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. J Neurosci. 2006 Oct 11;26(41):10380-6.

15.Buchen， L. Neuroscience: Illuminating the brain. Nature 465， 26–28 (2010). https://doi.org/10.1038/465026a

16.Shirai F， Hayashi-Takagi A. Optogenetics: Applications in psychiatric research. Psychiatry Clin Neurosci. 2017 Jun;71(6):363-372.

17.Adamantidis AR， Zhang F， Aravanis AM， Deisseroth K， de Lecea L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature 2007; 450: 420–424.

18.Zhou T， Zhu H， Fan Z， Wang F， Chen Y， Liang H， Yang Z， Zhang L， Lin L， Zhan Y， Wang Z， Hu H. History of winning remodels thalamo-PFC circuit to reinforce social dominance. Science. 2017 Jul 14;357(6347):162-168. doi: 10.1126/science.aak9726. PMID: 28706064.

19.Witten IB， Lin SC， Brodsky M et al. Cholinergic interneurons control local circuit activity and cocaine conditioning. Science 2010; 330: 1677–1681.

20.Tye KM， Mirzabekov JJ， Warden MR et al. Dopamine neurons modulate neural encoding and expression of depression-related behaviour. Nature 2013; 493: 537–541.

21.Ahmari SE， Spellman T， Douglass NL et al. Repeated cortico-striatal stimulation generates persistent OCD-like behavior. Science 2013; 340: 1234–1239.

22.Adhikari A， Lerner TN， Finkelstein J et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature 2015; 527: 179–185.

23.Sahel JA， Boulanger-Scemama E， Pagot C， Arleo A， Galluppi F， Martel JN， Esposti SD， Delaux A， de Saint Aubert JB， de Montleau C， Gutman E， Audo I， Duebel J， Picaud S， Dalkara D， Blouin L， Taiel M， Roska B. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021 Jul;27(7):1223-1229.

24.Ramirez S， Liu X， MacDonald CJ et al. Activating positive memory engrams suppresses depression-like behaviour. Nature 2015; 522: 335–339.

本文来自微信公众号：nextquestion（ID：gh_2414d982daee），作者：轻盈，编辑：lixia