不同的SARS-CoV-2毒株虽然尚未对大流行的进程产生重大影响，但未来却可能会。本文来自微信公众号：Nature自然科研（ID：Nature-Research），原文作者：Ewen Callaway，原标题为：《新冠病毒正在发生突变——影响有多大？》，题图来自：视觉中国
今年，COVID-19在全球传播，David Montefiori想知道导致这种大流行的致命病毒在人际传播过程中可能会发生怎样的变化。Montefiori是一名病毒学家，他的大部分职业生涯都在研究HIV的偶然突变是如何帮助它逃避免疫系统的。他认为，同样的事情也可能发生在SARS-CoV-2身上。
SARS-CoV-2刺突蛋白的“闭合”和“开放”构象，该蛋白能够与人类细胞上的受体结合。一种常见的环状突变似乎使这种蛋白质更倾向于开放的构象，这可能使病毒更容易进入细胞。图片来源：结构数据由K. Shen & J. Luban提供
今年3月，在杜克大学领导艾滋病疫苗研究实验室的Montefiori联系了他的长期合作伙伴、HIV演化方面的专家Bette Korber。Korber是新墨西哥州洛斯阿拉莫斯国家实验室（LANL）的计算生物学家，她已经开始搜索数千个冠状病毒基因序列，寻找可能在全球传播过程中改变病毒特性的突变。
与艾滋病毒相比，SARS-CoV-2在传播过程中的变化要慢得多。但有一个突变让Korber很感兴趣。它存在于编码刺突蛋白的基因中，该蛋白能够帮助病毒颗粒穿透细胞。Korber发现这种突变在COVID-19患者的样本中反复出现。在刺突蛋白的第614个氨基酸位置，由于复制错误而改变了病毒RNA序列29,993个核苷酸其中之一，使得天门冬氨酸（生物化学中缩写为D）有规律地被甘氨酸（G）取代。病毒学家称之为D614G突变。
今年4月，Korber、Montefiori和其他人在bioRxiv上发布的预印本中发出了警告，称“D614G突变发生的频率正以惊人的速度增长”[1]。它迅速成为欧洲主要的SARS-CoV-2谱系，随后发展到美国、加拿大和澳大利亚。论文宣称，D614G代表了一种“传染性更强的SARS-CoV-2”，它是自然选择的产物。
这些观点使许多科学家感到沮丧。他们说，目前还不清楚D614G病毒谱系是否传染性更强，也不清楚其出现是否表明有任何异常。但这一警报迅速传遍了媒体。尽管许多新闻报道包括了研究人员的说明，但一些新闻标题宣称病毒正在向更危险的方向发生变异。回想起来，Montefiori说，他和他的同事后悔将这种变异的增长描述为“惊人的”（alarming）。在7月2日发表在《细胞》杂志上的同行评议版本中，这个词被删除了[2]。
这篇文章激起了人们对D614G的狂热兴趣。即使是那些不相信这种突变已经改变了病毒特性的人也认为它是有趣的——因为它的迅速出现和普遍性。几个月来，在几乎所有的SARS-CoV-2测序样本中都发现了这一谱系（见“全球传播”）。
他说：“这一变异株现在成了大流行。因此，它的特性很重要。”耶鲁大学公共卫生学院的病毒流行病学家Nathan Grubaugh，和他的两位同事在一篇针对Korber和Montefiori相关发现的《细胞》短评中写道[3]。
来源：Ref. 8
到目前为止，这项工作的结果并不像Montefiori和Korber的预印本所暗示的那么清楚。一些实验表明，携带这种变异的病毒更容易感染细胞。其他工作则揭示了可能的好消息：这种变异或许意味着疫苗可以更容易靶向SARS-CoV-2。
但许多科学家说，目前还没有确凿的证据证明D614G对病毒的传播有显著影响，也没有确凿的证据证明它的上升是自然选择的结果。北卡罗来纳大学教堂山分校的冠状病毒学家Timothy Sheahan说：“这种突变可能意味着什么，也可能没有什么。目前尚无定论。”
Sheahan、Grubaugh和其他人表示，研究人员对于冠状病毒突变仍有更多的疑问而不是答案，而且还没有人发现任何应该引起公共卫生关注的SARS-CoV-2变化。但是研究突变的细节可能对控制大流行很重要，还可能有助于预防最令人担忧的突变，即那些可能帮助病毒逃避免疫系统、疫苗或抗体疗法的突变。
变化的出现
在中国发现SARS-CoV-2后不久，研究人员开始分析病毒样本，并将其遗传信息发布到网上。变异——通常是那些不同个体所携带病毒之间的单核苷酸变异——使研究人员能够将密切相关的病毒联系起来并追踪病毒的传播，以此推测SARS-CoV-2开始感染人类的时间。
某些病毒基因组由RNA编码，如SARS-CoV-2、HIV和流感病毒，在宿主体内复制时往往会迅速发生突变，因为复制RNA的酶很容易出错。例如，在严重急性呼吸系统综合征（SARS）病毒开始在人类中传播后，它产生了一种缺失突变，这可能减缓了它的传播速度[4]。
但测序数据表明，冠状病毒的变化速度比大多数其他RNA病毒都要慢，这可能是因为一种“校对”酶可以纠正潜在致命的复制错误。瑞士巴塞尔大学的分子流行病学家Emma Hodcroft说，一种典型的SARS-CoV-2病毒在其基因组中每个月只会积累两个单核苷酸变异——这一变化率大约是流感病毒的二分之一以及艾滋病的四分之一。
目前已经对超过9万个分离株进行了测序并公开（见www.gisaid.org），而其他基因组数据也强调了这种稳定性。伦敦大学学院的计算遗传学家Lucy Van Dorp说，从世界上任何地方收集的两株SARS-CoV-2病毒，在其长达29,903个核苷酸的RNA序列中平均只有10个不同。她正在追踪这些差异，寻找那些赋予其演化优势的迹象。
尽管SARS-CoV-2病毒的突变率很低，但研究人员已经对超过12000个SARS-CoV-2基因突变进行了分类。然而科学家发现突变的速度比理解这些突变的速度要快。许多突变对病毒传播或致病的能力没有影响，因为它们不会改变蛋白质的形状，而那些改变蛋白质的突变更有可能损害而不是改进病毒。Hodcroft是致力于实时分析SARS-CoV-2基因组的Nextstrain项目成员，他说：“破坏比修复要容易得多。”
来源：L. Van Dorp et al. (http://go.nature.com/3GSRNH6); Refs 2, 11, 12; B. E. Young et al. Lancet 396, 603–611 (2020)
许多研究人员推测，如果某种突变确实帮助病毒传播得更快，那这种突变的产生很可能早于病毒第一次感染人类或获得有效人传人的能力。在这个地球上几乎每个人都易受感染的时期，可能并没有什么演化压力促使病毒更好地传播，所以即使是潜在有益的突变也可能不会迅速发展。哈佛大学陈曾熙公共卫生学院的流行病学家William Hanage说：“就病毒而言，每一个被它感染的人都是一块好肉。并没有让病毒更强大的选择压力。”
快速传播
当Korber看到D614G的快速扩散时，她想她可能已经找到了一个有意义的自然选择的例子。这种突变能够引起她的注意是因为它在刺突蛋白中的位置，刺突蛋白是“中和”抗体的主要靶点，这种抗体与病毒结合并使病毒无传染性。而且这种变异的病毒在世界上多个地区的出现频率也在上升。
1月下旬，在中国和德国收集的病毒样本中首次发现D614G；大多数科学家推测这种突变发生在中国。现在，它几乎总是伴随着SARS-CoV-2基因组其他部分的三种突变——这可能是大多数D614G病毒有着共同祖先的证据。
D614G在欧洲的迅速发展引起了Korber的注意。在今年3月欧洲大陆大部分地区被封锁之前，存在着未突变的D病毒和突变的G病毒，遗传学家当时取样的D病毒在大多数西欧国家流行。Korber、 Montefiori和他们的团队报告说，在三月份，G病毒在整个非洲大陆出现频率上升，到四月份则占了主导地位[1, 2]。
3月12日，意大利总理朱塞佩·孔特（Giuseppe Conte）宣布可能将关闭交通枢纽以控制SARS-CoV-2疫情后，乘客们在帕多瓦火车站。此时，带有D614G突变的病毒正在整个欧洲传播。来源：Roberto Silvino/NurPhoto/Getty
但是有利于G病毒的自然选择并不是对这种模式唯一的解释，甚至也不是最有可能的解释。G变种在欧洲的优势可能只是由于偶然，例如，这种变异碰巧在到达欧洲的病毒中更常见一些。
少数个体似乎对大多数病毒的传播负有责任，早期偶然倾向于G病毒可以解释该谱系现在明显的优势。这种创始者效应（founder effects）在病毒中很常见，尤其是当病毒不受控制地传播时，就像3月中下旬前SARS-CoV-2在欧洲大部分地区的传播情况。
Korber和她的同事试图排除创始者效应，他们在4月的预印本[1]中表示，D614G在加拿大、澳大利亚和美国部分地区迅速占据主导地位（冰岛是个例外，在那里G病毒在其暴发早期被D病毒取代）。该团队分析了来自英国谢菲尔德的住院数据，并没有发现携带这种突变的病毒使人们病情加重的证据。但是，感染G病毒的人的鼻子和口腔中的病毒RNA水平似乎比感染D病毒的人略高。
许多科学家不相信D614G的上升是显著的，或者与大流行有那么大的关系。Sheahan说：“我认为该预印本非常不成熟。”
Montefiori说，他和Korber对D614G的看法基于他们对艾滋病毒的研究。他们发现，即使是看起来不重要的突变也会对免疫系统识别这种病毒产生深远的影响。“我们对此感到震惊，我们需要看它是否会对疫苗产生影响。”他说。
大量实验室研究
为了进一步检验D614G是否提高了病毒的传播能力，Montefiori在实验室条件下评估了它的效果。由于需要生物安全控制，他不能在实验室里研究天然的SARS-CoV-2病毒。因此，他研究了一种利用SARS-CoV-2刺突蛋白感染细胞的转基因艾滋病病毒。这种“假病毒”颗粒是病毒学实验室的主要工具：它们使对埃博拉病毒等致命病原体进行安全研究成为可能，也使检测突变的影响变得容易。
马萨诸塞大学医学院的研究人员Thomas Nyalile测试了D614G刺突蛋白变异对传染性的影响。该实验使用的是一种不需要高度生物安全控制的假病毒。图片来源：Jeremy Luban
今年6月第一个报告针对D614G进行假病毒实验的团队，是由斯克里普斯研究所[5]的病毒学家Hyeryun Choe和Michael Farzan领导的。其他几个团队也在bioRxiv上发布了类似的研究（Montefiori的实验和另一个合作者的实验都发表在《细胞》杂志上[2]）。
这些研究小组使用了不同的假病毒系统，并在不同种类的细胞上进行了测试，但实验得出了相同的结论：携带G突变的病毒感染细胞的能力要比携带D突变的病毒强得多，在某些情况下，其效率是D突变病毒的10倍。
在实验室测试中，“我们所有人都一致认为，从D到G使病毒颗粒更具传染性。” 马萨诸塞大学医学院的病毒学家Jeremy Luban说。但是这些研究附带了许多警告，而且它们与人类感染的相关性尚不清楚。Grubaugh说：“让人恼火的是，大家在非常严格的控制条件下得出结果，并说这对大流行意味着什么。事实上我们还远远不知道。”
在大多数情况下，假病毒只携带冠状病毒刺突蛋白，因此实验只测量了这些颗粒进入细胞的能力，而没有测量它们在细胞内的影响，更不用说对生物体的影响了。它们也缺乏几乎所有D614G病毒所携带的其他三种突变。“归根结底，它们并不是这个病毒。”Luban说。
一些实验室现在正在研究只在单个氨基酸上有所不同的传染性SARS-CoV-2病毒。在实验室培养的人类肺和气管细胞中，以及在雪貂和仓鼠等实验室动物中进行测试。Sheahan说，对于有经验和生物安全能力来操纵病毒的实验室来说，“这就像是一些最基础的工作。”第一项研究是由德克萨斯大学医学分部的研究人员领导的，发布在9月2日的预印本上[6]。研究发现，在人类肺细胞系和气道组织中，突变病毒比D病毒更具传染性，而且在感染仓鼠的上呼吸道中，突变病毒的含量更高[6]。
即使是这些实验也不能提供绝对的答案。一些研究表明，中东呼吸综合征（MERS）病毒刺突蛋白的某些突变能够造成小鼠更严重的感染，而该蛋白中的其他突变对人和可能是人MERS感染病毒宿主的骆驼只有很小的作用，爱荷华大学的冠状病毒学家Stanley Perlman表示。
D614G对人类SARS-CoV-2传播有影响的最明显的证据来自一个雄心勃勃的英国研究项目——COVID-19英国基因组学联盟（COVID-19 Genomics UK Consortium），该项目分析了大约25000个病毒样本的基因组。从这些数据中，研究人员确定了1300多个病毒进入英国并传播的例子，包括D型和G型病毒。
由英国爱丁堡大学演化生物学家Andrew Rambaut、伦敦帝国理工学院流行病学家Erik Volz和卡迪夫大学生物学家Thomas Connor领导的研究小组，研究了由D病毒传播的62个COVID-19集群和由G病毒传播的245个集群在英国的传播情况。
研究人员在感染这两种病毒的人中没有发现临床差异。然而，G病毒倾向于比不携带变异的谱系传播速度稍快，并形成更大的感染群。Volz说，他们对传播率差异的估计徘徊在20%左右，但真正的数值可能更高或更低。“从绝对意义上讲，这并没有太大的影响。”Rambaut说。
Rambaut说，D614G可能是一种适应，它帮助病毒感染细胞或与不携带这种突变的病毒竞争，而对SARS-CoV-2在人与人之间或在人群中传播的方式几乎没有改变。“这可能是对人类或某些人类细胞真正的适应，”Grubaugh表示同意，“但这并不意味着任何改变。适应并不一定要让它更具传染性。”
Grubaugh认为D614G已经获得了科学家们太多的关注，部分原因是已经有许多关于它的高知名度论文。“科学家们对这些突变有着疯狂的迷恋。”他说。但他也认为D614G是了解这种基因多样性不高的病毒的方法之一。他说：“身为病毒学家的我看着这些东西，会觉得研究起来很有趣。它创造了一个完整的兔子洞，你可以深入探究不同的东西。”
也有其他研究者和Grubaugh持相同观点。Luban说，对D614G的深入研究应有助于解释SARS-CoV-2如何与细胞融合，这个过程或许能被药物阻断或被疫苗靶向。
7月16日发布在bioRxiv上的一篇更新版的假病毒实验中[8]，Luban的团队使用冷冻电镜分析了带有D614G突变的刺突蛋白结构。这种刺突蛋白由三个相同的肽段组成，它们按“开放”或“闭合”的方向排列。先前的研究表明，其中至少两个多肽需要呈开放状态，从而使病毒颗粒与细胞膜融合[9]。
Luban的研究团队发现，携带G刺突蛋白突变的病毒变种更有可能处于这种状态（见“使刺突蛋白变松散的突变”）。Montefiori和Korber在LANL的同事Sandrasegaram Gnanakaran领导下进行的计算建模工作得出了同样的结论[10]。Luban说：“看起来这个分子机器已经准备好以某种方式运行，而D病毒则不可以。”
来源：Structural data from K. Shen & J. Luban
尚且无法逃脱抗体
大多数现有证据表明，D614G不能阻止免疫系统的中和抗体识别SARS-CoV-2，这正是Montefiori担心的。这可能是因为突变不在刺突蛋白的受体结合区域（RBD）——许多中和抗体的靶点：RBD与细胞受体蛋白ACE2结合是病毒进入细胞的关键一步。
但有证据显示，其他突变可能有助于病毒逃避某些抗体。洛克菲勒大学的病毒学家Theodora Hatziioannou和Paul Bieniasz领导的一个研究团队，对一种家畜病原体水疱性口炎病毒进行了基因改造，使其利用SARS-CoV-2刺突蛋白感染细胞，并在有中和抗体存在的情况下生长。他们的目标是选择能够使刺突蛋白逃避抗体识别的突变。
该实验产生了对从COVID-19康复者血液中提取的抗体以及正在开发用于治疗的强效单克隆抗体具有耐药性的刺突蛋白突变体。Hatziioannou、Bieniasz和他们的团队报告说，尽管突变的频率很低，每一个刺突突变都是在从患者身上分离出来的病毒序列中发现的，表明正向选择并没有使突变更常见[11]。
其他科学家正试图通过预测可能的重要突变，从而领先于SARS-CoV-2的演化过程。弗雷德·哈钦森癌症研究中心的演化病毒学家Jesse Bloom领导了一个团队，创造了近4000个突变版本的刺突蛋白RBD，并测量了这种改变如何影响刺突蛋白的表达及其与ACE2结合的能力。大多数突变对这些特性没有影响或阻碍，尽管少数突变改善了这些特性[12]。其中一些突变已经在COVID-19患者身上发现，但是Bloom的团队没有发现任何变异的自然选择迹象。他说：“可能这种病毒与ACE2结合的程度和它现在需要的差不多。”
研究人员并没有测试这些突变是否允许病毒阻止抗体的行动，但Bloom团队的结果表明这些变化是可能的。“病毒将获得突变并改变其对抗体和免疫的敏感性是一种可能性，但绝不是肯定的。”Bloom说。
根据研究其他冠状病毒的经验，这可能需要数年时间。针对普通感冒冠状病毒的研究，在多个季节取样，已经确定了其对免疫反应的一些演化迹象。但是，伯尔尼病毒学和免疫学研究所的RNA病毒学家Volker Thiel说，变化的步伐是缓慢的，“这些病毒株或多或少保持不变。”
由于世界上大多数人仍然对SARS-CoV-2易感，免疫不太可能是目前病毒演化的主要因素。但Sheahan说，随着全人口免疫力的提高——无论是通过感染还是通过接种疫苗，免疫规避突变的不断产生可能帮助SARS-CoV-2永久性地存在，当它感染那些因为曾经感染或接种疫苗而有残留免疫力的个体时，可能会引起主要为轻微的症状。
“如果这种病毒继续以一种更常见的、致感冒的冠状病毒形式存在，我不会感到惊讶。”但还有一种可能：我们对冠状病毒感染（包括SARS-CoV-2）的免疫反应不够强烈或不够持久，不足以产生导致病毒毒株发生显著改变的选择压力。
如果抗体疗法使用不当，令人担忧的突变也可能变得更加常见——例如，如果COVID-19患者接受一种抗体，而这种抗体可能因单一病毒突变而失效。研究人员说，单克隆抗体的鸡尾酒疗法（每一种抗体都能识别刺突蛋白的多个区域）可能会降低通过自然选择获得这种突变的几率。疫苗在这一点上引起的关注较少，因为就像人体的自然免疫反应一样，它们往往会激发一系列抗体。
Montefiori团队7月发布在bioRxiv上的一项研究[13]发现，D614G的改变甚至有可能使病毒更容易成为疫苗的靶标。小鼠、猴子和人类接种了一系列RNA疫苗中的一种，其中一种是辉瑞制药公司正在研发的，它们产生的抗体被证明对G病毒的阻断作用比对D病毒更强。
Montefiori说，由于G病毒现在无处不在，这一发现是“好消息”。但作为一名科学家，他研究过艾滋病病毒通过突变逃避了许多针对它的疫苗，他仍然对SARS-CoV-2逃避人类免疫反应的可能性保持警惕。Luban 对此表示赞同：“我们需要密切关注其他变化。”
参考文献：
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2. Korber, B. et al. Cell 182, 812–827 (2020).
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12. Starr, T. N. et al. Cell 182, 1295–1310 (2020).
13. Weissmann, D. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.22.20159905 (2020).
原文以 The coronavirus is mutating-does it matter? 为标题发表在2020年9月8日的《自然》新闻特写版块
© nature doi: 10.1038/d41586-020-02544-6
本文来自微信公众号：Nature自然科研（ID：Nature-Research），原文作者：Ewen Callaway，由施普林格·自然上海办公室负责翻译。中文内容仅供参考，一切内容以英文原版为准。