本文来自微信公众号：biokiwi（ID：biokiwi），作者：bio kiwi，题图来自：视觉中国
前言：
本文无意制造紧张或恐慌情绪，仅对一种可能发生的潜在风险进行讨论。随着新型冠状病毒（SARS-CoV-2）不同突变株的出现，疫情也许会进入一个更加难以预测的阶段，因此一些极小概率的不良情况也应当被纳入考虑的范围内，防患于未然。更何况基于如今的生物医学水平，核酸测序等技术能够很快辨别不同变异株，并辅助核酸检测试剂盒等工具的迭代更新。
国内外多款新冠病毒疫苗附条件上市，这无疑给疫情笼罩下的人们带来希望；“全民免费疫苗”的政策更是鼓舞人心。只不过碍于产能、运输条件等因素，疫苗的全面接种需要分阶段、逐步进行，也就是需要时间。
图源：齐鲁网
如果疫苗不会失效，在这段时间里，精准的检测、合理的隔离以及尽职的流行病学调查依旧十分重要。其中，核酸检测格外关键，因为它是除疫苗外疫情管控的根本，也是阻击新冠病毒的第一道关卡。
尽管核酸检测试剂盒所使用的反转录定量荧光聚合酶链式反应（RT-qPCR）、恒温扩增等技术本身已经相对成熟，但由于取样覆盖范围有限、部分患者呼吸道病毒量较低、以及样品保存等问题，假阴性的情况时有发生，一些疑似患者需要经过多次核酸检测才能确诊。
biokiwi 上周的文章曾提到，新冠病毒在这场与人类等动物之间的“拉锯战”中正积累着突变和变异，作为对抗人类决心和智慧的“武器”。（《新冠病毒的武器——突变与进化》）
那么除开疫苗，新冠病毒的这般“武器”有可能影响第一道关卡——核酸检测吗？
核酸检测是怎么回事？
从本质上来讲，核酸检测就像“捉迷藏”游戏里的作弊器一样，能够帮助人类快速、准确地找到藏匿的对象——新冠病毒。并非偷看或提前知晓病毒躲藏的过程，核酸检测主要通过把病毒变多、信号增大的方式，来确定它们的存在。
试想一下，若干个蚂蚁大小的新冠病毒躲在一片广袤的“森林”之中，几乎无法被发现，除非它们啃倒了一些“树木”；即病毒感染下呼吸道细胞，发生咳嗽、炎症等临床症状的时候，人类才会意识到被感染的危险。
核酸检测则能够让人类在“树木”被侵蚀之前，就知晓病毒是否存在。
如果存在新冠病毒，试剂盒中大量的引物会和病毒核酸序列中的目标位点相互配对结合，并在扩增蛋白酶的帮助下将病毒复制上百亿、甚至千亿倍。
荧光探针结合来检测病毒的存在 | 图源：Wikipedia
但病毒数量变多并不代表被看见，这时候试剂盒中另一个重要组分——荧光探针便派上了用场。这些探针会通过相同的方式，与病毒或复制的病毒序列配对结合，并发出荧光信号，通过仪器检测荧光信号就能够判断病毒的存在与否。
在论文或相关报道中经常出现的 Ct （threshold cycle）值，实际上是指达到荧光检测阈值的循环次数；每循环一次，病毒就会被复制一倍。因为病毒数量越多，最终检测到的荧光信号越强。为了能够知道患者样本中病毒多少，核酸检测会设置一个荧光强度的阈值，并记录样本达到该值需要的循环次数 Ct；Ct 值越低，说明样本中病毒浓度越高。
当然，以上是将核酸检测这一过程简化以后、便于理解的说法。实际情况要比这个复杂得多，同时也包含了不少容易干扰最终结果的因素，例如咽拭子等样品采集、保存的操作，环境因素造成新冠病毒基因 RNA 的降解、以及 RNA 逆转录成 DNA 的效率等等，这也是为什么一些患者需要反复进行多次核酸检测才能确诊。
变异会影响核酸检测吗？
了解了核酸检测原理以后，文章标题中出现的问题会发生吗？
虽然概率极低，但答案是有可能的。回顾前文中核酸检测原理的解释，如果病毒核酸序列发生突变和变异，其与引物和荧光探针的配对结合也有一定概率受到影响。
高灵敏度和高特异性让 PCR 或恒温扩增技术成为诊断利器，但也正是因为极高的特异性，核酸诊断也面临着，几个位点的变化就导致其失效的可能。类似的情况2017年在法国曾发生过，一种真菌病源体的线粒体基因因突变导致其 qPCR 的检测中出现了假阴性。
对诊断技术进行评估时，一般使用灵敏度（sensitivity）和特异性（specificity）这两个关键性指标。灵敏度是指整体检测人群中正确识别阳性患者的比例，而特异性表征的是正确识别阴性患者的能力。
新冠病毒全基因组 | Khailany et al., 2020
新冠病毒的核酸检测通常使用病毒中相对丰富的基因作为目标靶点，例如柏林病毒研究所和德国柏林感染研究中心推荐使用 RdRp（RNA dependent RNA Polymerase） 和 E 基因（Envelope protein）；中国疾病预防控制中心推荐使用 ORF1ab 和 N 基因（Nucleocaploid protein）；美国疾病预防控制中心则使用了两个 N 基因位点（N1和N2）。
虽然同时使用两个不同的目标靶点可以规避掉不少假阴性的风险，甚至有些公司的产品包含了三个位点；但是新冠病毒作为单链 RNA 病毒，其突变和变异的速度本就比双链 DNA 要容易，再加上这一场“拉锯战”持续时间较长，给了新冠病毒更多变化和进化的机会。
国产（扩增类）核酸检测试剂盒检测靶点情况| biokiwi整理制图
因此没人能够保证，未来不会出现带有特定突变的新冠病毒变异株，可以躲过已有的核酸检测；甚至它可能在世界的某个角落已经出现。2021年1月8日，美国食品及药物管理局（FDA）就曾发表过类似的预警。
FDA 关于基因变异可能导致核酸检测假阴性的预警 | 截图自美国 FDA 官网
值得庆幸的是，即便这样的小概率事件发生了，在人类面前也没什么大不了的。基于基因测序技术，新的引物和荧光探针可以很快被设计并生产，用以迭代更新核酸检测试剂盒产品。
只不过如果能提早有所准备，对病毒进行实时监测、定期对不同来源的样本进行测序核实，就能够避免这一小概率事件背后暗藏的大麻烦。
在这场被人类影响的自然选择里，新冠病毒在不断的变异和进化。
目前，新冠病毒似乎还未发生这样一个避人耳目的突变方向，亦或者是人类还没发现它们。但倘若这种情况发生，这类突变的病毒开始传播、积累和肆虐的时候，病毒和人类的关系就可能发生微妙的变化。
不同于英国等地发现的新冠病毒变异株，那些突变会使它们的传播能力更强大，更容易感染寄主；也不同于通过突变使得疫苗失效，因为这种突变本质上是帮助病毒躲避宿主免疫系统带来的压力。
如果逃脱核酸检测的变异株被选择了出来，则是让新冠病毒在其进化的过程中，绕过了一个完完全全由人类创造的标准和难关，而这是否意味着病毒变得更加“智慧”了呢？
参考资料：
1. Khailany RA, Safdar M, Ozaslan M. Genomic characterization of a novel SARS-CoV-2. Gene Rep. 2020 Jun;19:100682.
2. Huang LH, Lin PH, Tsai KW, Wang LJ, Huang YH, Kuo HC, Li SC. The effects of storage temperature and duration of blood samples on DNA and RNA qualities. PLoS One. 2017 Sep 19;12(9)
3. Le Gal S et al., A misleading false-negative result of Pneumocystis real-time PCR assay due to a rare punctual mutation: A French multicenter study. Med Mycol. 2017 Feb 1;55(2):180-184.
4. Alan J.Cann. Principles of Molecular Virology. Fifth Edition. University of Leicester, UK. Academic Press
5. 袁应华，刘瑾，成洁，朱敏，孙奋勇，罗兰，快速液体培养法检测呼吸道标本中的肺炎支原体，国际检验医学杂志，2013年2月第34卷第3期
本文来自微信公众号：biokiwi（ID：biokiwi），作者：bio kiwi