本文来自微信公众号：Nature Portfolio（ID：nature-portfolio），作者：Jyoti Madhusoodanan，原文标题：《细菌对抗生素耐药？创新方法或能解决这一世界性难题 |《自然》技术特写》，题图来自：视觉中国
2007年，Maha Farhat在南非德班的一家医院照顾病人。许多人感染了HIV（艾滋病病毒）。但是，令当时的住院医师Farhat和她的病人焦虑不安的感染并不是由病毒引起的，而是一种细菌：结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，肺结核的病原体）。特别令她担心的，是对普通抗生素有耐药性的菌株。
尽管免疫功能低下的个体特别容易感染结核病，但并非艾滋病患者才会患病。2019年，全球有140万人被结核分枝杆菌夺去生命，其中HIV仅20.8万人。Farhat如今是哈佛大学的医生和生物信息学家，她说虽然结核病曾被COVID-19短暂取代，但它仍然是全球头号传染病杀手。耐药性结核杆菌是造成这一问题的主要原因。
细菌对抗生素的耐药性是一项世界性难题。新的解决方案希望能改变局面。来源：Joao Silva/NYT/Redux/eyevine
各种类型的抗药性病原体引发了一场抗生素耐药性危机，威胁到公共卫生、农业、畜牧业等各领域。但是找出这些菌株并确定有效的治疗方法是个棘手的工作。在资源有限的国家，很难建设起具备处理特别传染性病原体（如结核分枝杆菌）资格的实验室，而用于检测药物敏感性的仪器可能需要数日才能返回结果。在许多情况下，医生只有在一种或多种标准抗生素失败后才进行耐药性检测。在等待结果期间，患者可能会开始一个不必要或无效的抗生素疗程，或未经治疗就离开诊所。
Farhat和其他研究者正求助于诸如原子力显微镜、基因组学和机器学习等工具，以建造能在数分钟内提供结果的即时诊断测试，进而最大限度地减少错误或不必要的处方使用。德国格赖夫斯瓦尔德大学医学中心的临床微生物学家Evgeny Idelevich说：“加快检测速度是当下所需的最重要进展。”
检测细菌生长
圆盘扩散试验是评估微生物药物敏感性的金标准，可追溯到1889年。研究人员在琼脂盘上培养细菌，然后将含有抗菌药物的小纸片贴在细胞表面。如果药物杀死细菌或阻止细菌生长，纸片周围的区域就会变得透明，表明微生物对药物敏感。
一些公司利用此原理开发了自动化检测的抗生素敏感性测试仪器，例如美国BD Biosciences公司的BD Phoenix以及法国bioMérieux公司的VITEK 2。这些系统在含有抗生素的液体培养中培养细菌，并检测代表细菌生长或死亡的光学变化。由于临床医生必须将样本送到临床微生物实验室，再加上检测通常需要4-8个小时，故可能需要一天或更长时间才能获得结果[1]。
但研究人员也在探索通常与物理科学更密切的分析方法，而不是单纯依靠微生物实验室。
例如，2018年，Idelevich设计了一种基于MALDI TOF的液体培养测试微型版本。MALDI TOF是一种质谱技术，它使用激光诱导基质电离，然后离子通过长“飞行管”，最后根据它们的质量和电荷来识别分子。Idelevich等将两种病原体（铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌）微滴培养物直接放于MALDI TOF的固体基质上，并且每一个细菌微滴都用不同的药物处理。然后，他们通过专门用于细菌鉴定的MALDI Biotyper对样本进行处理。特征谱峰的强度可以表明培养菌是否对抗生素敏感或耐药[2]。
2013年，意大利国家研究理事会的Giovanni Longo等发现，当他们把致病性大肠杆菌加在悬臂（微型跳水板样结构）上，使其暴露于抗生素。由于悬臂上附着的活细菌的微小运动，悬臂会上下移动。如果微生物对抗生素敏感，运动就会停止。在原子力显微镜下，几分钟内就能看到这种运动，这早于直接观察到微生物复制，也意味着相比于检测细菌生长的方法，此测试可以更快地识别活细菌[3]。
伦敦大学学院纳米技术研究员Rachel McKendry和她当时的研究生Isabel Bennett希望将这种方法应用到临床。但是，在皮氏培养皿中，将细菌附着在长度为200微米的悬臂上，说起来容易做起来难。Bennett说：“悬臂只有一小部分能附着细菌，有时候它们要么聚集成块，要么附着太少。”
Bennett与Longo的团队合作对这一过程进行微调时，发现了反射光的巨大差异，表明即使微生物没有被束缚在悬臂上，也可以发现类似的细菌运动。因此，研究团队改变了策略：当细菌漂浮在悬臂表面时，他们改变了设置来追踪细菌。他们用一种坚硬的反光材料制作了悬臂，并开发了软件来分析细菌的运动，这样一来读数就与溶液中细菌的数量成正比[4]。McKendry说，与目前的方法相比，这种看似简单的信号实际上是检测抗性的好方法。
Bennett建议，尽管该系统尚未商业化，但可以对其进行调整并扩大到临床使用。反射表面可以转变成嵌入型，便于将其放置在常规使用的微量滴定板中，并用DVD播放器的光学阅读器代替原子力显微镜来捕捉信号。她说：“这可能是一种非常简单、低成本的设备。”
美国波士顿大学的物理学家Kamil Ekinci正在研究另一种反映细菌抗生素耐药性的替代品：电流。他的团队将含有肺炎克雷伯杆菌（引起尿路感染的常见原因）的尿液样本直接放入含有抗生素的微流体装置单个通道中，并通过通道跟踪电导率[5]。Ekinci说：“如果细菌生长并堵塞了通道，它们就会产生更大的电阻。我们大体上是将细菌的生长信号转化为了电信号。”
Ekinci补充道，这样做的优势是电信号比显微镜图像更容易放大和展示。他说：“原理上我们的技术可以检测单个细菌的分裂。”不过他补充说，该方法可能不适用于所有细菌，特别是一些生长缓慢的病原体，如结核分枝杆菌。
检测分子标记
基于细菌生长的检测方法简单、便宜且无特异性，这种单一的检测方法适用于广泛的病原体。但是，由于检测结果取决于生长条件和使用正确浓度的抗生素，Susanne Häussler说它“任何别的方面都是缺点”。她在哥本哈根Rigshospitalet医院研究医学微生物学。
Häussler等正考虑一种替代方法——基因组学，来寻找耐药性的线索。哈佛大学流行病学家Sophia Koo说，这种“不依赖培养的检测方法”是该领域的下一个重大转变。
斯坦福大学传染病研究员Gary Schoolnik说，检测抗生素耐药性机制有关的基因是实现快速诊断的理想途径，因为它不需要长时间的细菌培养。但是，美国梅奥诊所的临床微生物学家Thomas Grys说，关键要知道细菌基因组中的哪些序列是耐药性关键，“不然你很可能会遗漏一个新的机制，或者检测到一个实际上并不会产生抗药性的基因片段。”
纸片扩散试验是揭露抗生素有效性的常用方法。来源：Doncaster and Bassetlaw Hospitals/SPL
Schoolnik也是Visby医学的首席医疗官，这家企业在加州创办，赢得了由美国国立卫生研究院以及美国卫生与公众服务部下属生物医学高级研究和发展管理局发起的“抗微生物药物耐药性诊断”挑战，并于2020年获得了1900万美元奖励。
该公司的检测是使用简单的手持设备进行一次性的即时检验，以检测淋球菌等性传播病原体的耐药性。该测试侧重于对环丙沙星（一种治疗淋球菌感染的常用口服抗生素）产生耐药性的基因突变。淋球菌菌株对环丙沙星耐药或敏感取决于编码酶gyrase A的基因突变。
基于PCR的检测方法在临床的应用有限，因为它需要仪器、试剂和培训过的技术人员。Visby的诊断测试是通过一个简单的颜色变化来简化分析，从而绕过这些限制。扩增后的基因片段会进入设备中的一个腔室，该腔室包含针对每个基因突变体的捕获探针。探针和基因片段的结合会导致颜色变化，这将反映淋球菌对环丙沙星是敏感还是耐药[6]。
其他人则继续探索全基因组测序，以捕获导致抗药性的基因突变谱。但基于这些信息开发低成本、快速的检测方式仍然是个难题。研究基因组学与机器学习的英国伯明翰大学数据科学家Nicole Wheeler认为，“这不仅与抗性基因的存在有关，还与它的表达有关。我们收集的转录组学和蛋白质组学数据越多，我们就越有可能提高预测耐药性的精确度。”
单纯基于基因组测序的技术对某些病原体很有效，如肠道沙门氏菌（Salmonella enterica），但多种调控基因的突变会改变其他病原体的基因表达模式（从而导致耐药性），包括铜绿假单胞菌。Häussler说：“一般而言，所有转录组数据都在基因组中。但是，有时候观察转录组数据比搜寻所有可能改变基因表达的突变更容易。”
例如，2014年，日本大阪理化研究所（RIKEN）的生物工程师古澤力研究了实验室大肠杆菌菌株在不同抗生素下的适应生长，并且他可以使用基因表达的变化来预测抗性，这比基因组DNA序列更准确[7]。古澤说，基因表达和抗药性之间的相关性明显高于抗药性和基因组标记之间的相关性。
未来预测细菌耐药性
Häussler等人的工作优化了基因组和转录组标记的联用，将其作为预测铜绿假单胞菌抗生素耐药性的最佳标记[8]。
但为了改进模型，他们求助于机器学习。机器学习并非简单地识别产生耐药性的基因突变，而是利用算法识别DNA和RNA变异的特征，预测菌株对抗生素的耐药性[8]。Häussler表示，算法只能帮助识别关键特征，这不会成为最终诊断测试的一部分。不过Wheeler说，这种方法还是可以解决仅通过基因组获得所有“细菌-药物”组合的问题。
这些算法不仅能告诉医生病原体目前的耐药性情况，还能揭示菌株在治疗过程中可能产生的抗生素耐药机制。然而，“仍然很难判断一个算法是否值得信任，”Wheeler说，“它们是个黑箱。即使你有全部的代码和数据，也不一定知道，比方说，是什么让模型判断样本A会对阿奇霉素产生耐药性。”
开发人员正在努力解决的另一个问题是过度拟合，Wheeler说，算法可能会“记住数据中大量不重要的特征”，而不是学习找到真正的相关性。由于细菌的基因序列可能非常相似，机器学习工具可能会过度简化问题，得出错误的结论。Wheeler将这个问题比作能力不足的图像搜索：通过许多农畜照片进行训练的算法，可能会将一张开阔地的照片识别成羊。细菌经常通过不属于其基因组的DNA小环状片段相互传递抗生素抗性基因。“但由于基因组的其余部分相同，算法可能会判定菌株仍然敏感，”她说，“而我们想要这些算法模型能从中学到的是抗药性机制。”
鉴于结核病研究和测试的种种限制，Farhat采用了一种机器学习方法，使用整个基因组序列进行预测。今年4月，她和同事描述了一种名为GenTB的网络工具，它可以预测细菌对几种结核病药物的耐药性[9]。该工具的性能随着输入序列数据的质量和所选药物而变化。Farhat说，尽管导致细菌对结核病一线药物高达80%耐药性的是一种常见突变，但有几种罕见的突变能小幅提高微生物对二线药物的耐药性。她说：“有时只有当存在数个这类突变时，你才会看到抗药性。”
尚未完成
无论采用哪种方法，研究人员都面临着同样的根本挑战：设计一种能在现有设备上有明显改进的诊断方法。Grys表示，目前的检测已经可以在24小时内将结果反馈给临床医生，且每次检测只需1-2美元。“问题不在于一项检测是否有效，而在于它是否比我们现有的更好。重要的是制定规划以帮助我们实现这些目标。”
一些正在开发的测试，能处理的样品种类、或细菌/抗生素的种类有限。例如，Visby诊断目前仅限于淋球菌感染，而Ekinci微流体设备需要尿样，而且不能处理多种细菌引起的感染。其他需要先进显微镜或光谱测定（如悬臂）的设备则需要加以调整，才能被全球资源匮乏的诊所中非专业的人员使用。bioMérieux微生物学研究主任Alex van Belkum说，因为许多检测都是用少量药物测试1-2个微生物，所以它们只攻克了“冰山一角”。他说，“这些方法与目前实验室的抗生素敏感性自动检测系统之间还有很大的差距。”
McKendry说在新冠疫情期间，已经证明快速检测对发现和阻止病毒传播尤为关键，同样地，低成本的即时诊断对减少抗生素滥用也极其重要。“抗生素耐药性是一个非常复杂的问题，新的检测方法只是解决方案的一环。”
参考文献：
1. van Belkum, A. et al. Nature Rev. Microbiol.18, 299–311 (2020).
2. Idelevich, E. A., Sparbier, K., Kostrzewa, M. & Becker, K. Clin. Microbiol. Infect. 24, 738–743 (2018).
3. Longo, G. et al. Nature Nanotechnol. 8, 522–526 (2013).
4. Bennett, I., Pyne, A. L. B. & McKendry, R. A. ACS Sens.5, 3133–3139 (2020).
5.Yang, Y., Gupta, K. & Ekinci, K. L. Proc. Natl Acad. Sci. USA117, 10639–10644 (2020).
6. Morris, S. R. et al. Lancet Infect. Dis. 21, 668–676 (2021).
7. Suzuki, S., Horinouchi, T. & Furusawa, C. Nature Commun. 5, 5792 (2014).
8. Khaledi, A. et al. EMBO Mol. Med. 12, e10264 (2020).
9. Gröschel, M. I. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.03.27.437319 (2021).
原文以Innovative tools take aim at antibiotic-resistant microbes为标题发表在2021年8月23日《自然》的技术特写版块上
本文来自微信公众号：Nature Portfolio（ID：nature-portfolio），作者：Jyoti Madhusoodanan